Terapia Celular 

Tras la exposición de la duramadre, se realizó una inyección intracerebral de 0,5 U decolagenasatipoIV(Sigma-Aldrich,Madrid,Espan ̃a)disuelta en 2 l de suero durante 5 min con la ayuda de una jeringuilla Hamilton de 25 l unida a un microinyector . La inyección se realizó tomando de referencia el bregma, con las siguientes coordenadas: 0,04 mm posterior, 3,5 mm lateral, 6 mm ventral. La colagenasa provoca en este modelo una hemorragia intracerebral que se localiza en la región del núcleo caudado (fig. 1).

Tras sustituir los animales que fallecieron como conse- cuencia de la lesión, en este estudio se realizaron 2 grupos experimentales, cada uno de ellos de 10 animales: a)Grupo experimental trasplantado con CMM. Fueron tratados con inyección intracerebral en la zona de la lesión cerebral y, tras 2 meses de evolución, de 5 × 106 CMM suspendidas en 10 l de suero fisiológico. b) Grupo control. Formado por otros 10 animales, a los que se administró el mismo volumen de suero fisiológico, en la misma zona y también después de 2 meses de evolución.

Obtención y caracterización de las células madre mesenquimales donantes

Para la obtención de las CMM donantes se utilizaron ratas macho Wistar, con un peso entre 200-250 g. Tras sacrificar los animales con una mezcla de 70% de CO2 y un 30% de O2 se aislaron las tibias y los fémures y en condiciones esté- riles se cortaron las epífisis. Tras extraer la médula ósea mediante lavado con una jeringuilla con aguja del n.◦ 26 car- gada con medio alfa MEM suplementado con antibiótico y 10% de suero fetal, se disgregó la suspensión celular obtenida. La médula ósea extraída se colocó en medio alfa-MEM completo, suplementado con antibiótico y 20% de suero fetal bovino. Pos- teriormente las células de la médula ósea fueron disgregadas y luego filtradas a través de una malla de nylon de 70 micras. La suspensión celular obtenida se sembró en un frasco de cultivo de 75 cm2 e incubadas en una estufa a 37 ◦C con un 5% de CO2. A las 48 h de incubación se eliminó el sobrenadante que con- tenía restos celulares y células no adherentes, permaneciendo en cultivo las células adherentes. Posteriormente el cultivo se lavóconbufferfosfatosalino(PBS),pH:7,4estéril,an ̃adiendo posteriormente 12 cc de medio alfa-MEM completo con 20% de FBS, que fue reemplazado cada 48-72h, durante 14 días. Cuando las células alcanzaron una confluencia aproximada del 90%, se levantaron del frasco de cultivo. Cuando las células llegaron a una confluencia del 80%, se sometieron a una incu- bación con 3 ml de tripsina 0,25%/1 mM EDTA durante 4-5 min a 37◦C. Tras este periodo de incubación se inactivó la tripsina con 6 ml de medio alfa-MEM completo. Las células obtenidas se centrifugaron 2 veces a 1.200rpm durante 10min. Final- mente se diluyó el pellet obtenido en medio alfa-MEM/10%FBS y se sometió a recuento mediante el test de viabilidad de azul tripán. Tras el recuento, las células madre se cultivaron de nuevo en frascos de 75cm2 en una concentración de 8.000 células/cm2 en presencia de 12 cc de medio alfa-MEM/10%FBS completo. Las CMM utilizadas para el trasplante se sometieron a una tercera centrifugación a 1.200 rpm durante 15 min. Final- mente, el pellet se resuspendió en suero salino. Se realizó una caracterización fenotípica de las CMM mediante citometría de flujo, expresando CD29 y CD90 y careciendo de expresión (≤ 5% positivo) de CD11b, CD45 o CD31.

 

Desde el momento de producir la HIC y a lo largo de los 8 meses de duración del estudio (6 meses tras la administra- ción cerebral de CMM suspendidas en suero fisiológico o de suero fisiológico únicamente) se valoró el déficit neurológico de todos los animales por medio de diversos tests (Video- Tracking Box-test, mNSS test, Rota-rod). Los datos recogidos de valoración funcional en ambos grupos experimentales se analizaron mediante técnicas estadísticas, como el test de análisis de varianza utilizando el programa SPSS v15.0, al objeto de comparar diferencias estadísticas, con un valor de significación de p < 0,05.

Los resultados que obtuvimos confirmaron la eficacia de este tipo de terapia celular, logrando una recuperación neuro- lógica en los animales con trasplante de CMM en comparación con los controles8,23-25. La diferencia se consideró estadística- mente significativa a partir de los 2 meses tras el trasplante, con una disminución progresiva del déficit neurológico en el curso de los meses siguientes, en los animales que recibieron CMM, mientras que los animales que recibieron solo suero fisiológico no mostraron ningún tipo de recuperación, con una estabilización del déficit neurológico a partir de los 6 meses tras la provocación de la HIC. La fig. 2 muestra los datos evolutivos de déficit neurológico detectado en ambos grupos experimentales mediante el test mNSS.

Bibliografia 

Otero, L., Zurita, M., Bonilla, C., Aguayo, C., Rico, M. A., & Vaquero, J. (2012). Perspectivas de la terapia celular en las secuelas del accidente cerebrovascular hemorrágico. neurocirugia, 23(5), 193-199.
http://neurocirugia.elsevier.es/index.php?p=watermark&idApp=UINPBA00004B&piiItem=S1130147312001042&origen=neurocirugia&web=neurocirugia&urlApp=http://www.revistaneurocirugia.com/&estadoItem=S300&idiomaItem=es




Pregunta 
¿Podría usarse estas bacterias productoras de neurotransmisores para el tratamiento de enfermedades neuronales en las cuales intervengan los neurotransmisores?

El sistema nervioso entérico, también conocido como segundo cerebro produce varios neurotransmisores igual que en el SNC pero además, se ha encontrado que varios tipos de bacterias de la microbiota normal del intestino los produce, entre los más importantes se encuentran el GABA, un inhibidor del sistema nervioso y la serotonina relacionada con el estado de ánimo.

Varias enfermedades neuronales son debido a una alteración en la función o producción de neurotransmisores, por ejemplo la falta de GABA conlleva a los episodios epilépticos, problema de ansiedad mientras que la falta de serotonina provoca depresión.

Obteniendo el gen que bacteriano que produce estos naurotransmisores sería posible la creación de transgénicos para tratar varias patologías del sistema nervioso.

Transgénicos en Enfermedad Cerebrovascular 

Modelos animales transgénicos empleados en el estudio del endotelio

Óxido nitrico-sintetasa endotelial (e-NOS)

Respecto de los ratones transgénicos para e-NOS, existe un ratón transgénico capaz de expresar la e-nos perteneciente al bovino.31 Tal animal expresa dicha proteína en corazón, pulmones, aorta y útero, pero con niveles de expresión más bajos en cerebro y en hígado; estos animales exhiben un fenotipo de hipotensión.

Existe un animal transgénico que expresa la e-NOS de origen humano acoplada a una proteína fluorescente; asimismo, se aportan evidencias en el sentido de que la enzima e-NOS expresada es funcional y que su expresión se encuentra en algunos órganos, como corazón, hígado, riñones, arenales. En el ratón transgénico que sobreexpresa a la óxido-nítrico sintetasa endotelial, se ha documentado presencia de hipotensión sin incremento en el volumen de orina ni de frecuencia cardiaca. En el estudio en el que se describe este animal transgénico se refiere un hallazgo relevante que consiste en disminución en el efecto de vasodilatadores dependientes de óxido nítrico; sin embargo, la relajación dependiente de cAMP permanece sin alteraciones.

Apolipoproteínas en conejos transgénicos

Diversas características hacen del modelo del conejo un excelente ejemplar para el estudio de factores que afectan la fisiología del endotelio. En esta especie la apolipoproteína apo B es similar a la proteína de humanos en su composición química y en su contenido de apoproteína. El hígado del conejo carece de mecanismos de edición del RNAm de apo B, como ocurre en el humano que produce apo B-100, la cual contiene lipoproteínas de baja densidad. Respecto de la apolipoprotreína A-1 se refiere la existencia de un conejo transgénico que contiene cADN de humano que codifica para la proteína apo- A-1, también se informa la existencia de un conejo transgénico que posee la particularidad de expresar dicha proteína humana en el hígado.

En términos generales, cuando a los conejos transgénicos de esta proteína se les administran dietas altas en colesterol, desarrollan aterosclerosis.38 También se han desarrollado otros modelos transgénicos con base en el conejo, como apoli- poproteína A, apolipoproteína B-100, apolipoproteína E3, en las cuales la expresión más considerable está restringida al hígado. En el caso del conejo transgénico de apolipoproteína E2, se desarrolló la aterosclerosis.

Eritropoyetina

Actualmente se cuenta con un ratón que sobreexpresa la eritropoyetina de origen humano y cuyo promotor promueve la sobreexpresión del transgene en células nerviosas. En este modelo se informó un incremento de casi el doble en valores de hematócrito, hemoglobina y eritrocitos, al compararse con el tipo silvestre; estas determinaciones se efectuaron en un rango de edad de entre tres y seis meses. Asimismo, no se encontraron alteraciones en la frecuencia cardiaca ni en la presión sanguínea sistólica.En secciones histológicas obtenidas a partir de tejido cardiaco transgénico, no se observaron signos de tromboembolismo.

Ventajas

•      Permiten estudiar el desarrollo de las enfermedades en periodos de tiempo mayores y por tanto más realistas

•      Conocer los detalles del funcionamiento de los genes que enfermedades es la clave en la búsqueda de mejores tratamientos, terapias y procedimientos diagnósticos. 

•       herramienta importante para estudiar enfermedades inducidas por el medio ambiente

•      Utilización como biorreactores, es decir, como medio de obtención de grandes cantidades de un producto biológico

•      Ensayos de seguridad de vacunas y productos químicos

•      xenotrasplantación, lo cual aliviaría la escasez de corazones y riñones humanos

Desventajas 

•      Nuevas proteinas que se expresan cuando se insertan genes de otras especies pueden desencadenar reacciones alérgicas o hipersensibles en algunas personas

•      Pocos fetos logran sobrevivir

•       

•      La introducción de una nueva información genética (el transgén) dentro del genoma de un organismo puede presentar algunos problemas en relación a dónde y cuándo expresar el transgén, tal como se indica a continuación:

•       

•      Lugar de integración indeterminado (efecto de posición) 

•      Metilación y falta de expresión 

•      Mosaicismo (germinal y somático) 

•      Expresión específica/ectópica 

• Expresión variable

Bibliografía 

 Flores-Pérez FI, Pérez-Martínez M. Avances en el estudio de la fisiología y patología endotelial en modelos animales Advances in the study of endothelial pathology and physiology in animal models. Vet. Méx. 2006;37:2.

http://www.medigraphic.com/pdfs/vetmex/vm-2006/vm062h.pdf

Terapia con stem cells 

El reto clínico en la ECV es lograr la restauración definitiva y a su vez, mejorar o revertir los daños en el sistema nervioso central a través de la reparación neuronal con células madre. Estas son células indiferenciadas o no especializadas que tienen la capacidad de replicarse ilimitadamente y que bajo ciertas condiciones fisiológicas o experimentales pueden ser inducidas a diferenciarse en células específicas, por lo que tienen un gran potencial terapéutico. Los científicos trabajan con Células Madre Embrionarias (CME), células madre germinales y adultas o somáticas

Las CME son aisladas de la masa celular interna del blastocisto y poseen el más amplio potencial de autorenovación; son pluripotentes, es decir, que puede dar lugar a todos los tipos de células dentro del embrión en desarrollo. Sin embargo, la técnica y las dificultades éticas relacionadas con las CME han promovido la búsqueda de alternativas como las células madre adultas, las cuales son células no especializadas encontradas entre células diferenciadas en un tejido o en un órgano como la médula ósea, músculo, piel, páncreas, hígado, intestino y cerebro Estas células madre adultas tienen la capacidad de dar lugar al desarrollo de células de tejidos totalmente diferentes del que las alojó, lo que se conoce como plasticidad o trasdiferenciación

La vía de administración de las células madre puede ser sistémica (vasos sanguíneos) o local (cerebro). Estas células poseen capacidad migratoria hacia el área lesionada. Por lo general, las células de la medula ósea son trasplantadas sistémicamente mientras que las células neuronales se administran localmente; la primera técnica es más atractiva, menos invasiva y ha demostrado ser más efectiva a segunda tiene la ventaja de proporcionar acceso inmediato a la zona lesionada

Bibliografía

Villa-Delgado R., Moscote-Salazar LA., Alcalá-Cerra G., Sabogal-Barrios R. Potencial terapéutico de las células madre en la enfermedad cerebrovascular. revista de los estudiantes de medicina de la universidad industrial de santander. méd.uis.2010;23:43-8

Sosa I, Mengana Y, García JD, Subiros N, Cruz J, Muñoz A, Nuñez Y, García JC. La eritropoyetina humana recombinante como terapia para la neuroprotección en la isquemia cerebral. Biotecnología Aplicada. 2008;25(1-2):25.