Terapia Celular 

Tras la exposición de la duramadre, se realizó una inyección intracerebral de 0,5 U decolagenasatipoIV(Sigma-Aldrich,Madrid,Espan ̃a)disuelta en 2 l de suero durante 5 min con la ayuda de una jeringuilla Hamilton de 25 l unida a un microinyector . La inyección se realizó tomando de referencia el bregma, con las siguientes coordenadas: 0,04 mm posterior, 3,5 mm lateral, 6 mm ventral. La colagenasa provoca en este modelo una hemorragia intracerebral que se localiza en la región del núcleo caudado (fig. 1).

Tras sustituir los animales que fallecieron como conse- cuencia de la lesión, en este estudio se realizaron 2 grupos experimentales, cada uno de ellos de 10 animales: a)Grupo experimental trasplantado con CMM. Fueron tratados con inyección intracerebral en la zona de la lesión cerebral y, tras 2 meses de evolución, de 5 × 106 CMM suspendidas en 10 l de suero fisiológico. b) Grupo control. Formado por otros 10 animales, a los que se administró el mismo volumen de suero fisiológico, en la misma zona y también después de 2 meses de evolución.

Obtención y caracterización de las células madre mesenquimales donantes

Para la obtención de las CMM donantes se utilizaron ratas macho Wistar, con un peso entre 200-250 g. Tras sacrificar los animales con una mezcla de 70% de CO2 y un 30% de O2 se aislaron las tibias y los fémures y en condiciones esté- riles se cortaron las epífisis. Tras extraer la médula ósea mediante lavado con una jeringuilla con aguja del n.◦ 26 car- gada con medio alfa MEM suplementado con antibiótico y 10% de suero fetal, se disgregó la suspensión celular obtenida. La médula ósea extraída se colocó en medio alfa-MEM completo, suplementado con antibiótico y 20% de suero fetal bovino. Pos- teriormente las células de la médula ósea fueron disgregadas y luego filtradas a través de una malla de nylon de 70 micras. La suspensión celular obtenida se sembró en un frasco de cultivo de 75 cm2 e incubadas en una estufa a 37 ◦C con un 5% de CO2. A las 48 h de incubación se eliminó el sobrenadante que con- tenía restos celulares y células no adherentes, permaneciendo en cultivo las células adherentes. Posteriormente el cultivo se lavóconbufferfosfatosalino(PBS),pH:7,4estéril,an ̃adiendo posteriormente 12 cc de medio alfa-MEM completo con 20% de FBS, que fue reemplazado cada 48-72h, durante 14 días. Cuando las células alcanzaron una confluencia aproximada del 90%, se levantaron del frasco de cultivo. Cuando las células llegaron a una confluencia del 80%, se sometieron a una incu- bación con 3 ml de tripsina 0,25%/1 mM EDTA durante 4-5 min a 37◦C. Tras este periodo de incubación se inactivó la tripsina con 6 ml de medio alfa-MEM completo. Las células obtenidas se centrifugaron 2 veces a 1.200rpm durante 10min. Final- mente se diluyó el pellet obtenido en medio alfa-MEM/10%FBS y se sometió a recuento mediante el test de viabilidad de azul tripán. Tras el recuento, las células madre se cultivaron de nuevo en frascos de 75cm2 en una concentración de 8.000 células/cm2 en presencia de 12 cc de medio alfa-MEM/10%FBS completo. Las CMM utilizadas para el trasplante se sometieron a una tercera centrifugación a 1.200 rpm durante 15 min. Final- mente, el pellet se resuspendió en suero salino. Se realizó una caracterización fenotípica de las CMM mediante citometría de flujo, expresando CD29 y CD90 y careciendo de expresión (≤ 5% positivo) de CD11b, CD45 o CD31.

 

Desde el momento de producir la HIC y a lo largo de los 8 meses de duración del estudio (6 meses tras la administra- ción cerebral de CMM suspendidas en suero fisiológico o de suero fisiológico únicamente) se valoró el déficit neurológico de todos los animales por medio de diversos tests (Video- Tracking Box-test, mNSS test, Rota-rod). Los datos recogidos de valoración funcional en ambos grupos experimentales se analizaron mediante técnicas estadísticas, como el test de análisis de varianza utilizando el programa SPSS v15.0, al objeto de comparar diferencias estadísticas, con un valor de significación de p < 0,05.

Los resultados que obtuvimos confirmaron la eficacia de este tipo de terapia celular, logrando una recuperación neuro- lógica en los animales con trasplante de CMM en comparación con los controles8,23-25. La diferencia se consideró estadística- mente significativa a partir de los 2 meses tras el trasplante, con una disminución progresiva del déficit neurológico en el curso de los meses siguientes, en los animales que recibieron CMM, mientras que los animales que recibieron solo suero fisiológico no mostraron ningún tipo de recuperación, con una estabilización del déficit neurológico a partir de los 6 meses tras la provocación de la HIC. La fig. 2 muestra los datos evolutivos de déficit neurológico detectado en ambos grupos experimentales mediante el test mNSS.

Bibliografia 

Otero, L., Zurita, M., Bonilla, C., Aguayo, C., Rico, M. A., & Vaquero, J. (2012). Perspectivas de la terapia celular en las secuelas del accidente cerebrovascular hemorrágico. neurocirugia, 23(5), 193-199.
http://neurocirugia.elsevier.es/index.php?p=watermark&idApp=UINPBA00004B&piiItem=S1130147312001042&origen=neurocirugia&web=neurocirugia&urlApp=http://www.revistaneurocirugia.com/&estadoItem=S300&idiomaItem=es




Pregunta 
¿Podría usarse estas bacterias productoras de neurotransmisores para el tratamiento de enfermedades neuronales en las cuales intervengan los neurotransmisores?

El sistema nervioso entérico, también conocido como segundo cerebro produce varios neurotransmisores igual que en el SNC pero además, se ha encontrado que varios tipos de bacterias de la microbiota normal del intestino los produce, entre los más importantes se encuentran el GABA, un inhibidor del sistema nervioso y la serotonina relacionada con el estado de ánimo.

Varias enfermedades neuronales son debido a una alteración en la función o producción de neurotransmisores, por ejemplo la falta de GABA conlleva a los episodios epilépticos, problema de ansiedad mientras que la falta de serotonina provoca depresión.

Obteniendo el gen que bacteriano que produce estos naurotransmisores sería posible la creación de transgénicos para tratar varias patologías del sistema nervioso.